Thème Vectorisation et Diagnostic

• Projet I : Transfert de gènes
• Projet II : Prodrogues - Pénétration cellulaire 
• Projet III : Dosages immunologiques des anti-infectieux et de leurs métabolites  

Projet I : Transfert de gènes  (C. Di Giorgio, G. Godeau, J. Greiner, P. Vierling)

Le développement de "virus synthétiques″ comme systèmes vecteurs de gènes  thérapeutiques  et  plus  généralement  d’acides  nucléiques  constitue  une  alternative  extrêmement prometteuse à l’utilisation de systèmes vecteurs d’origine virale (rétrovirus,  virus adéno-associés, adénovirus…), non seulement pour la thérapie génique mais aussi  pour l’étude des fonctions et de la  régulation des gènes  et protéines. De  tels systèmes  sont des enjeux scientifiques et technologiques majeurs pour le traitement des maladies  héréditaires  et  acquises  et  notamment  des  cancers  (remplacement  d’un  gène  déficient  suppresseur de tumeurs, inhibition d’un oncogène dominant, stimulation, modification et  amplification de  la  réponse  immunitaire antitumorale,  sensibilisation des  tumeurs  et/ou  protection des cellules saines à la chimio/radiothérapie, approche gène suicide, etc…). 
La mise au point d’un système synthétique de transfert de gènes efficace est dépendante  d’une  connaissance  précise  des  nombreuses  étapes  menant  in  fine  à  l’expression  du  transgène au sein de la cellule cible. Ces étapes, qui sont autant d’obstacles à son  expression, demandent toutes à être optimisées, et elles concernent :

* Le contrôle des propriétés biophysiques des vecteurs (stabilité et taille) :
•     Formulation du  gène  en  un  système  nanoparticulaire  stable  et  de  taille  la  plus  petite  possible  pour  faciliter  la  diffusion  dans  les  fluides  biologiques  et  au  travers  des barrières physiologiques.

* Le trafic extracellulaire (diminution des interactions non spécifiques et ciblage) : 
•     Couplage de polymères de type  PEG à la surface des nanoparticules pour diminuer les interactions non spécifiques.
•     Pénétration  intracellulaire :  celle-ci  est  effectuée  principalement  par  endocytose  non spécifique  (interactions  électrostatiques  avec  les  glycoprotéines  anioniques  exprimées à la surface cellulaire) et/ou par endocytose spécifique si le système est  pourvu d’un ligand spécifiquement reconnu par un récepteur exprimé par la cellule  cible.

* Le trafic intracellulaire (contrôle des voies d’entrée et migration vers et dans le noyau)
•     Routage intracellulaire : il comprend la sortie des vésicules d’entrée (par exemple sortie des endosomes avant fusion avec les  lysosomes dans le cas d’une entrée par voie clathrine) et la migration vers et dans le noyau. Ces deux étapes sont véritablement cruciales.
•     Expression du transgène en protéine thérapeutique (mise à profit de la machinerie  cellulaire pour la transcription du transgène en ARNm puis en protéine). Cette étape  est surtout liée à la construction plasmidique.

Nos principaux axes de recherche consistent ou ont consisté à apporter des solutions à chacun de ces facteurs limitants en tentant de formuler de tels virus synthétiques.

Représentation schématique d’un virus synthétique multifonctionnel

            Nous avons ainsi développé :
           
            (1) Des agents de transfert de gènes spécifiquement adaptés au transport et à la délivrance intracellulaire d’ADN (i) à partir de lipides cationiques fluorés, pour formuler les lipoplexes correspondants en leur conférant des propriétés originales en terme de stabilité (transfection en milieux agressifs) ou (ii) à partir de détergents dimérisables perfluoroalkylés (poly)cationiques, afin de formuler des nanoparticules monomoléculaires d’ADN qui soient cationiques, pour améliorer leur propriété de transfection et augmenter leur diffusion dans les fluides biologiques.

            (2) Des nanovecteurs fonctionnalisés pour un transfert de gènes spécifique et ciblé. Ces derniers sont constitués (i) de lipopolyamines galactosylées bolaamphiphiles, pour cibler les hépatocytes qui surexpriment les récepteurs asialoglycoprotéines (ASGP) ou (ii) de conjugués AMD3100-télomères polyaminés, pour le ciblage de cellules tumorales qui surexpriment le récepteur de chimiokines CXCR4 ou encore (iii) des nanoparticules monomoléculaires en ADN, mentionnées précédemment, fonctionnalisées par des ligands folates ou cVEGI, pour le ciblage de cellules tumorales surexprimant respectivement les récepteurs folates ou VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor).

            (3) Des nanovecteurs fonctionnalisés pour la délivrance nucléaire par le biais de conjugués de type intercalant-NLS.

Projet II : Prodrogues - Pénétration cellulaire  (A. Di Giorgio, N. Patino)

De nombreux composés actifs en tests acellulaires perdent leur potentiel antiviral du fait qu’ils franchissent peu ou pas les membranes cellulaires. C’est en particulier le cas de molécules contenant des PNA (Peptide Nucleic Acids, analogues d’oligonucléotides). Différentes stratégies sont décrits dans la littérature pour tenter d’améliorer la pénétration des PNA. De façon générale, ils sont soit conjugués à des peptides pénétrants (CPP), ce qui conduit fréquemment à leur séquestration dans les endosomes, soit encapsulés dans des liposomes cationiques, ce qui nécessite au préalable de devoir les hybrider avec une séquence d’ADN complémentaire. Récemment, il a été montré qu’il était possible de faire pénétrer efficacement des PNA en les conjuguant à un résidu cystéine lié par sa fonction thiol au cation lipophile 4-thiobutyltriphénylphosphonium (TBTP). Cette méthode permet de libérer des «PNA-cystéine» dans le cytoplasme de la cellule.

            En nous basant sur ces travaux, nous avons mis au point un nouveau type de vecteur qui, une fois couplé à un PNA, permet de le délivrer dans le cytoplasme de la cellule de façon non altérée (c’est-à-dire non lié à un groupement résiduel comme la cystéine). Le principe de vectorisation est le suivant: après franchissement des membranes cellulaires par diffusion passive (au moyen du TBTP qui utilise la différence de potentiel existant au niveau de ces membranes), la réduction intracellulaire du pont disulfure conduit à une entité qui se dégrade spontanément pour donner de l’épisulfure (éliminé de la cellule), du CO2 (solubilisé dans le cytoplasme) et le PNA actif «nu» (cf Figure ci dessous).

Projet III : Dosages immunologiques des anti-infectieux et de leurs métabolites   (S. Azoulay, A. Burger)

Nous avons mis en place une stratégie de dosages immunoenzymatiques d'antiprotéases et d'inhibiteurs non nucléosidiques de la rétrotranscritase du VIH, et préparé les haptènes et les immunogènes nécessaire à l'obtention d'anticorps spécifiques.

Les dosages mis au point sont d'une très grande sensibilité ( < 1 ng/mL) et permettent d'effectuer des mesures intracellulaires. Des études pharmacologiques en particuliers au niveau cellululaires sont ensuite réalisées.

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